Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)

HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom.

Pelaksanaan HPLC

Pengantar

HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.

HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.

Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat peka.

Kolom dan pelarut

Membingungkan, ada dua perbedaan dalam HPLC, yang mana tergantung pada polaritas relatif dari pelarut dan fase diam.

Fase normal HPLC

Ini secara esensial sama dengan apa yang sudah anda baca tentang kromatografi lapis tipis atau kromatografi kolom. Meskipun disebut sebagai “normal”, ini bukan merupakan bentuk yang biasa dari HPLC.
Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.

Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

Fase balik HPLC

Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.

Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom.

Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.

Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC.Melihat seluruh proses

Diagram alir HPLC

Injeksi sampel

Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan bagaimana mengetahui apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas (jika anda telah mempelajarinya).

Waktu retensi

Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:

• tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
• kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel)
• komposisi yang tepat dari pelarut
• temperatur pada kolom

Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati, jika anda menggunakan waktu retensi sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa.

Detektor
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.

Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV.

Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, anda sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut.

Interpretasi output dari detektor

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

Anda juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuanti?tas dari senyawa yang dihasilkan. Mari beranggapan bahwa tertarik dalam senyawa tertentu, X.

Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut, tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).

Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk mengetahu berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil.

Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika anda mempunyai dua substansi yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y), dapatkah anda mengatakan jumlah relatifnya? Anda tidak dapat mengatakannya jika anda menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.

Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini akan hanya memberikan puncak yang kecil.

Rangkaian HPLC pada spektrometer massa

Ini menunjukkan hal yang sangat menakjubkan! Pada saat detektor menunjukkan puncak, beberapa senyawa sementara melewati detektor dan pada waktu yang sama dapat dialihkan pada spektrometer massa. Pengalihan ini akan memberikan pola fragmentasi yang dapat dibandingkan pada data komputer dari senyawa yang polanya telah diketahui. Ini berarti bahwa identifikasi senyawa dalam jumlah besar dapat ditemukan tanpa harus mengetahui waktu retensinya.

http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kromatografi1/kromatografi_cair_kinerja_tinggi_hplc/

Beri Rating: Sebarkan: * Lintas Berita Digg Facebook Lintas Berita * * Spektrofotometri

Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan  sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube.

Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Sedangkan pengukuran menggunakan spektrofotometer ini, metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri.

Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual dengan studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi. Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombangdan dialirkan oleh suatu perkam untuk menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda.

Absorbsi sinar oleh larutan mengikuti hukum Lambert-Beer, yaitu :

A =     log ( Io / It )         =  a b c

Keterangan  : Io = Intensitas sinar datang

It = Intensitas sinar yang diteruskan

a = Absorptivitas

b = Panjang sel/kuvet

c = konsentrasi (g/l)

A = Absorban

Spektrofotometri merupakan bagian dari fotometri dan dapat dibedakan dari filter fotometri sebagai berikut :

1. Daerah jangkauan spektrum

Filter fotometr hanya dapat digunakan untuk mengukur serapan sinar tampak (400-750 nm). Sedangkan spektrofotometer dapat mengukur serapan di daerah tampak, UV (200-380 nm) maupun IR (> 750 nm).

2. Sumber sinar

Sesuai dengan daerah jangkauan spektrumnya maka spektrofotometer menggunakan sumber sinar yang berbeda pada masing-masing daerah (sinar tampak, UV, IR). Sedangkan sumber sinar filter fotometer hanya untuk daerah tampak.

3. Monokromator

Filter fotometere menggunakan filter sebagai monokrmator. Tetapi pada spektro digunakan kisi atau prisma yang daya resolusinya lebih baik.

4. Detektor

–   Filter fotometer menggunakan detektor fotosel

–   Spektrofotometer menggunakan tabung penggandaan foton atau fototube.

Komponen utama dari spektrofotometer yaitu :

1. 1. Sumber cahaya

Untuk radisi kontinue :

–         Untuk daerah UV dan daerah tampak :

–         Lampu wolfram (lampu pijar) menghasilkan spektrum kontiniu pada gelombang 320-2500 nm.

–         Lampu hidrogen atau deutrium (160-375 nm)

–         Lampu gas xenon (250-600 nm)

Untuk daerah IR

Ada tiga macam sumber sinar yang dapat digunakan :

–         Lampu Nerst,dibuat dari campuran zirkonium oxida (38%) Itrium oxida  (38%) dan erbiumoxida (3%)

–         Lampu globar dibuat dari silisium Carbida (SiC).

–         Lampu Nkrom terdiri dari pita nikel krom dengan panjang gelombang 0,4 – 20 nm

–      Spektrum radiasi garis UV atau tampak :

–       Lampu uap (lampu Natrium, Lampu Raksa)

–       Lampu katoda cekung/lampu katoda berongga

–       Lampu pembawa muatan dan elektroda (elektrodeless dhischarge lamp)

–       Laser

1. 2. Pengatur Intensitas

Berfungsi untuk mengatur intensitas sinar yang dihasilkan oleh sumber cahaya agar sinar yang masuk tetap konstan.

1. 3. Monokromator

Berfungsi untuk merubah sinar polikromatis menjadi sinar monokromatis sesuai yang dibutuhkan oleh pengukuran

Macam-macam monokromator :

–   Prisma

–   kaca untuk daerah sinar tampak

–   kuarsa untuk daerah UV

–   Rock salt (kristal garam) untuk daerah IR

–  Kisi difraksi

Keuntungan menggunakan kisi :

–   Dispersi sinar merata

–   Dispersi lebih baik dengan ukuran pendispersi yang sama

–   Dapat digunakan dalam seluruh jangkauan spektrum

1. 4. Kuvet

Pada pengukuran di daerah sinar tampak digunakan kuvet kaca dan daerah UV digunakan kuvet kuarsa serta kristal garam untuk daerah IR.

1. 5. Detektor

Fungsinya untuk merubah sinar menjadi energi listrik yang sebanding dengan besaran yang dapat diukur.

Syarat-syarat ideal sebuah detektor :

–         Kepekan yang tinggi

–         Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi

–         Respon konstan pada berbagai panjang gelombang.

–         Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi.

–         Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi.

Macam-macam detektor :

–    Detektor foto (Photo detector)

–      Photocell

–      Phototube

–      Hantaran foto

–      Dioda foto

–      Detektor panas

1. 6. Penguat (amplifier)

Berfungsi untuk memperbesar arus yang dihasilkan oleh detektor agar dapat dibaca oleh indikator.

1. 7. Indikator

Dapat berupa :

–         Recorder

–         Komputer

Resonansi Magnetik Inti (NMR)

Bagian ini menerangkan tentang spektrum proton RMI dan bagaimana spektrum tersebut dapat menjelaskan kedudukan atom-atom hidrogen dalam molekul organik.

Latarbelakang spektroskopi RMI

Resonansi magnetik inti mempunyai kaitan dengan sifat-sifat magnetik suatu inti tertentu.

Atom hidrogen sebagai magnet kecil

Jika anda mempunyai suatu kompas jarum, biasanya akan mengarah pada medan magnet bumi dengan arah utara. Jika jarum kompas tersebut anda putar dengan jari sehingga menunjukkan arah selatan – arah yang berlawanan dengan medan magnet bumi. Posisi ini sangat tidak stabil karena berlawanan dengan arah medan magnet bumi, dan jika anda membiarkannya jarum akan segera kembali ke posisi semula yang lebih stabil.

Inti hidrogen juga mempunyai perilaku seperti magnet kecil dan inti-inti hidrogen dapat juga diatur arahnya agar sesuai dengan arah medan magnet luar atau berlawanan dengan arah medan magnet luar. Arah yang berlawanan dengan medan adalah tak stabil (energinya tinggi). Ini memungkinkan untuk mengubah arahnya dari yang lebih stabil ke kurang stabil dengan memberikan energi yang sesuai.

Energi yang dibutuhkan untuk mengubahnya tergantung pada kekuatan medan magnet luar yang digunakan, tetapi biasanya dalam kisaran gelombang radio – pada frekuansi antara 60 – 100 MHz. (frekuansi radio BBC 4 adalah diantara 92-95 MHz!)

Hal ini memungkinkan untuk mendeteksi hubungan antara gelombang radio pada frekuensi tertentu dengan perubahan orientasi proton sebagai suatu puncak dalam grafik. Perubahan proton dari satu arah ke arah lain oleh gelombang radio disebut dengan kondisi resonansi.

Pengaruh lingkungan kimia atom hidrogen

Mungkinkah kita mendapatkan suatu proton yang terisolasi, kenyataannya proton mempunyai sesuatu yang mengelilinginya – terutama elektron. Adanya elektron ini akan mengurangi pengaruh medan magnet luar yang dirasakan oleh inti hidrogen.

Misalkan anda menggunakan frekuensi radio 90 MHz, dan anda mengatur besarnya medan magnet sehingga suatu proton yang terisolasi dalam kondisi resonansi.

Jika anda mengganti proton yang terisolasi dengan proton yang terhubung dengan sesuatu, proton tidak akan merasakan pengaruh yang penuh dari medan luar dan akan berhenti beresonansi(berubah dari satu arah magnetik ke arah yang lain). Kondisi resonansi tergantung pada adanya kombinasi yang tepat antara medan magnet luar dan frekuensi radio.

Bagaimanakah anda mengembalikan kondisi resonansi? Anda dapat sedikit meningkatkan medan magnet luar untuk mengimbangi pengaruh elektron.

Misalnya anda menghubungkan hidrogen dengan sesuatu yang lebih elektronegatif. Elektron dalam ikatan akan makin menjauh dari inti hidrogen, sehingga pengaruhnya terhadap medan magnet di sekitar hidrogen akan berkurang.

Untuk mengembalikan hidrogen pada kondisi resonansi, anda harus sedikit meningkatkan medan magnet luar untuk mengimbangi pengaruh elektron – tetapi tidak sebanyak jika hidrogen berada didekat atom X.

Rangkuman

Untuk suatu frekuensi radio yang diberikan (katakanlah, 90 MHz) atom hidrogen membutuhkan sedikit medan magnet untuk membuatnya beresonansi yang besarnya tergantung pada apa yang ada didekatnya – dengan kata lain kebutuhan medan magnet adalah untuk mengarahkan lingkungan atom hidrogen dalam suatu molekul.
Ciri-ciri spektrum RMI

Spektrum RMI yang sederhana adalah seperti berikut:

Puncak

Pada gambar terdapat dua puncak karena ada dua lingkungan hidrogen yang berbeda – dalam gugus CH3 dan gugus COOH yang mengandung oksigen. Mereka berada pada posisi yang berbeda dalam spektrum karena membutuhkan medan magnet luar yang sedikit berbeda untuk menyebabkannya beresonansi pada frekuensi radio tertentu.

Ukuran kedua puncak memberikan informasi yang penting, yaitu banyaknya atom hidrogen dalam tiap-tiap lingkungan. Bukan tinggi puncaknya tetapi perbandigan luas area di bawah puncak. Jika anda dapat menghitung luas area di bawah puncak pada diagram di atas, anda akan mendapatkan perbandingannya 3 (untuk puncak yang besar) dan 1 (untuk yang kecil).

Perbandingan 3:1 menunjukkan banyaknya atom hidrogen dalam dua lingkungan yang berbeda – hal ini sesuai untuk CH3COOH.

Perlunya standar sebagai pembanding – TMS

Sebelum kita menjelaskan makna skala pada posisi horisontal, kita akan menjelaskan tentang titik nol – pada bagian kanan skala. Nol adalah titik dimana anda akan mendapatkan suatu puncak yang disebabkan oleh atom-atom hidrogen dalam tetrametilsilan – biasanya disebut dengan TMS. Setiap pembacaan spektrum RMI akan dibandingkan dengan TMS ini.

Anda akan menemukan puncak pada beberapa spektra RMI yang ditimbulkan oleh TMS (pada nol), dan yang lainnya akan menjauhi puncak TMS ke sebelah kiri. Pada dasarnya, jika anda akan menganalisis spektrum dengan suatu puncak pada nol, anda dapat mengabaikannya karena itu adalah puncak dari TMS.

TMS dipilih sebagai standar karena beberapa alasan, diantaranya:

* TMS mempunyai 12 atom hidrogen yang semuanya memiliki lingkungan kimia yang sama. Mereka terikat oleh atom yang sama dengan cara yang sama sehingga tidak hanya menghasilkan puncak tunggal tetapi juga puncak yang kuat (karena ada banyak atom hidrogen).
* Hidrogen pada senyawa ini lebih terlindungi dibandingkan pada senyawa lain karena adanya elektron-elektron ikatan C-H. Ini artinya inti hidrogen lebih terlindungi dari medan magnet luar, dan anda harus meningkatkan medan magnet untuk membawa hidrogen ini kembali ke kondisi resonansinya.

Pengaruh dari hal ini adalah TMS menghasilkan puncak yang ekstrim pada sisi kanan. Dan puncak lain akan muncul di sebelah kirinya.

Pergeseran kimia

Skala horisontal ditunjukkan sebagai (ppm). dinamakan pergeseran kimia/chemical shift dan dihitung dalam bagian per juta/parts per million – ppm.

Suatu puncak dengan pergeseran kimia, misalnya 2.0 artinya atom-atom hidrogen yang memunculkan puncak tersebut memerlukan medan magnet 2 juta lebih kecil dari medan yang dibutuhkan oleh TMS untuk menghasilkan resonansi.

Suatu puncak pada pergeseran kimia 2.0 dikatakan mempunyai medan lebih rendah dari TMS (downfiled).

Pelarut untuk spektroskopi RMI

Spektra RMI biasanya ditentukan dari larutan substansi yang akan dianalisis. Untuk itu pelarut yang digunakan tidak boleh mengandung atom hidrogen, karena adanya atom hidrogen pada pelarut akan mengganggu puncak-puncak spektrum.

Ada dua cara untuk mencegah gangguan oleh pelarut. Anda dapat menggunakan pelarut seperti tetraklorometana, CCl4, yang tidak mengandung hidrogen, atau anda dapat menggunakan pelarut yang atom-atom hidrogennya telah diganti dengan isotopnya, deuterium, sebagai contoh CDCl3 sebagai ganti CHCl3. Semua spektrum RMI pada bagian ini menggunakan CDCl3 sebagai pelarut.

Atom-atom deuterium mempunyai sifat-sifat magnetik yang sedikit berbeda dari hidrogen, sehingga mereka akan menghasilkan puncak pada area spektrum yang berbeda.